半胱天冬酶在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。 Caspase 3/7（CPP32 / apopain）的激活對(duì)于細(xì)胞凋亡的起始是重要的。 Caspase 3/7也被鑒定為藥物篩選靶標(biāo)。半胱天冬酶抑制劑具有抗癌和其他藥理學(xué)潛力。已經(jīng)證明Caspase 3/7對(duì)肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物選擇性。 我們的Amplite 熒光Caspase 3/7檢測(cè)試劑盒使用（Z-DEVD）2 R110作為熒光指示劑，用于檢測(cè)caspase 3/7活性。R110衍生的半胱天冬酶底物可能是用于熒光檢測(cè)各種半胱天冬酶活性的最敏感的指示劑。R110肽是無色和無熒光的。通過半胱天冬酶裂解R110肽產(chǎn)生強(qiáng)熒光R110，其可以在510-530nm下熒光測(cè)量，在488nm激發(fā)，這是最常見的激發(fā)光源。半胱天冬酶誘導(dǎo)的R110水解的熒光增加與半胱天冬酶的活性成比例。

操作方法

1.準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.1對(duì)于粘附細(xì)胞：在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將細(xì)胞在20,000至80,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 90L下過夜，96孔板或5,000至20,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2對(duì)于非粘附細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細(xì)胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D賴氨酸平板或20,000至50,000細(xì)胞/孔/ 20L用于384孔聚-D賴氨酸板。 在實(shí)驗(yàn)之前，在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。

注意：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳細(xì)胞密度。

2.準(zhǔn)備庫存解決方案：

2.1在使用前，在室溫下使用組分A，B，C（如果需要，組分D和E）。

2.2如果需要，制備1mM Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲(chǔ)備液：將100μLDMSO（未提供）直接加入到Ac-DEVD-CHO小瓶（組分D）中。 該抑制劑可用于確認(rèn)熒光信號(hào)強(qiáng)度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。

注意：應(yīng)將未使用的抑制劑儲(chǔ)備液等分并在-20°C下干燥儲(chǔ)存。

3.準(zhǔn)備Caspase 3/7檢測(cè)溶液：

將50μL200X胱天蛋白酶3/7底物儲(chǔ)備溶液（組分A）和100μL1MDTT溶液（組分C）加入10mL測(cè)定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X caspase 3/7底物儲(chǔ)備液足以進(jìn)行100次測(cè)定，每次測(cè)定的反應(yīng)體積為100μL。 未使用的200X caspase 3/7底物儲(chǔ)備液應(yīng)等分，在-20°C干燥儲(chǔ)存，避光。

4.運(yùn)行Caspase 3/7測(cè)定：

4.1通過將10μL10X測(cè)試化合物（96孔板）或5μL5X測(cè)試化合物（384-板）加入PBS或所需緩沖液中來處理細(xì)胞。 對(duì)于空白孔（沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的化合物緩沖液。

4.2將細(xì)胞板在培養(yǎng)箱中孵育一段所需的時(shí)間（用喜樹堿處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的半胱天冬酶3/7測(cè)定溶液（來自步驟3）。

4.4將板在室溫下孵育至少1小時(shí)，避光。

注1：如果需要，在室溫下加入測(cè)定溶液10分鐘前，將1L Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1mM儲(chǔ)備液（來自步驟2.2）加入選定的樣品中，以確認(rèn)Caspase 3 / 7個(gè)類似的活動(dòng)。

注2：如果需要，通過將5mM R110標(biāo)準(zhǔn)品（組分E）稀釋到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中制備R110標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到系列稀釋的R110標(biāo)準(zhǔn)品，范圍為0-50M。將100μL連續(xù)稀釋的R110標(biāo)準(zhǔn)品加入含有的孔中。 在測(cè)量熒光之前的任何時(shí)間，100μLCaspase3/7測(cè)定溶液。 該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于測(cè)定含有胱天蛋白酶3/7的反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物的摩爾數(shù)。

4.5在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下，以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對(duì)于非粘附細(xì)胞）2分鐘。

4.6在Ex / Em = 490 / 525nm處觀察熒光增加。