半胱氨酸蛋白酶在細胞凋亡或程序性細胞死亡中是必需的，在發(fā)育和成年生活的大多數(shù)其他階段，并且因其在細胞中的作用而被稱為“劊子手”蛋白質(zhì)。免疫系統(tǒng)中也需要一些半胱天冬酶用于淋巴細胞的成熟。細胞凋亡失敗是腫瘤發(fā)展和自身免疫疾病的主要原因之一。半胱天冬酶也參與缺血和阿爾茨海默病。凋亡caspase有兩種類型：引發(fā)劑和效應劑。 啟動子半胱天冬酶（例如，CASP2，CASP8，CASP9和CASP10）切割效應半胱天冬酶的無活性前體形式，從而激活它們。效應子半胱天冬酶（例如，CASP3，CASP6，CASP7）依次切割細胞內(nèi)的其他蛋白質(zhì)底物，以觸發(fā)細胞凋亡過程。該級聯(lián)反應的起始受半胱天冬酶抑制劑的調(diào)節(jié)。

操作方法

1.使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的一般溶液Caspase測定

1.1在DMSO中制備10mM儲備溶液。

1.2制備2X半胱天冬酶底物（50μM）測定溶液，如下所示：

50 L基質(zhì)原液

100L DTT（1M）

400L EDTA（100 mM）

10mL Tris緩沖液（20mM），pH = 7.4

1.3將等體積的半胱天冬酶標準品或樣品與2X半胱天冬酶底物測定溶液（來自步驟1.2）混合，并在室溫下孵育溶液至少1小時。

1.4使用熒光酶標儀檢測熒光，或使用吸光度酶標儀檢測吸光度。

2.細胞Caspase檢測使用細胞滲透FMK半胱天冬酶探針

2.1在DMSO中制備2-5mM儲備溶液。

2.2根據(jù)需要對細胞進行處理。

2.3通過用20mM Hepes緩沖液（HHBS）稀釋Hanks中的DMSO儲備溶液（來自步驟2.1），制備2X可滲透的半胱天冬酶底物（20μM）測定溶液。

2.4用2X半胱天冬酶底物測定溶液（來自步驟2.3）混合等體積的處理細胞，并將細胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育至少1小時。

2.5用HHBS洗滌細胞至少一次。

2.6用流式細胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標儀監(jiān)測熒光強度。

3.細胞Caspase檢測使用細胞滲透性FMK Caspase探針（僅適用于＃13470-13476）

3.1通過向小瓶中加入50μLDMSO制備250X儲備溶液。

3.2根據(jù)需要對細胞進行處理。

3.3將250 X DMSO儲備溶液（來自步驟3.1）以1：250的比例（例如2 uL至500 uL細胞）添加到細胞溶液中，并將細胞在37°C，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1 小時。

3.4用HHBS洗滌細胞至少一次。

3.5用流式細胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標儀監(jiān)測熒光強度。