二氫乙錠可有效地作為測(cè)量活性氧物質(zhì)的探針。染料自由進(jìn)入細(xì)胞并脫氫成溴化乙錠。該探針已被廣泛用于NK細(xì)胞，并作為鑒定腫瘤中增殖和缺氧細(xì)胞的重要染料。已經(jīng)使用嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及HL60細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行了研究。該探針的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠區(qū)分超氧化物和H₂O_2,熒光發(fā)射發(fā)生在約600nm處。

用于染色細(xì)胞的樣品方案

以下過(guò)程提供了一般準(zhǔn)則，實(shí)際情況應(yīng)根據(jù)您的特定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行修改。

1.制備5-10 mM DMSO儲(chǔ)備溶液。應(yīng)將未使用的DMSO儲(chǔ)備溶液等分到單次使用的小瓶中并儲(chǔ)存在-20℃，避光。

2.在生理緩沖液（如PBS，HBSS，HEPES）中使染料的工作濃度為5-20μM。最佳工作濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

3.將染料工作溶液（來(lái)自步驟2）等體積（例如100μL細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中）加入細(xì)胞中，并在室溫或37℃下孵育細(xì)胞5至60分鐘。

4.在將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)物之前，確定負(fù)載細(xì)胞樣品的基線熒光強(qiáng)度。

5.陰性對(duì)照應(yīng)評(píng)估如下：

5.1檢查有沒(méi)有誘導(dǎo)物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無(wú)細(xì)胞混合物的熒光。 在沒(méi)有細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，熒光隨時(shí)間的逐漸增加可能會(huì)自發(fā)水解，導(dǎo)致水解的原因可能與大氣氧化或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。

5.2檢查已經(jīng)保持在生長(zhǎng)培養(yǎng)基或緩沖液中的未處理（對(duì)照）負(fù)載細(xì)胞的熒光。在健康細(xì)胞中，氧自由基被細(xì)胞酶和天然抗氧化劑消除。 在染料加載結(jié)束后，健康細(xì)胞應(yīng)表現(xiàn)出低水平的熒光，在實(shí)驗(yàn)期間相對(duì)穩(wěn)定; 可以觀察到熒光的逐漸增加（由于自動(dòng)氧化）或減少（由于細(xì)胞中的染料損失或光漂白）。在沒(méi)有任何刺激或誘導(dǎo)的情況下，健康的未經(jīng)處理的細(xì)胞中的熒光突發(fā)可以指示細(xì)胞死亡或一些其他氧化事件的進(jìn)展。

6.可以用叔丁基過(guò)氧化氫（TBHP）刺激陽(yáng)性對(duì)照至終濃度~100μM（基于細(xì)胞的敏感性和反應(yīng)增加或減少劑量而定）。